YTHDC1调控m6A修饰mRNA出核转运 | m6A专题

论文标题：YTHDC1 mediates nuclear export of N6-methyladenosine methylated mRNAs刊登日期：2017年10月发表杂志：eLIFE影响因子：8.3研究机构：芝加哥大学何川课题组

摘要：

m6A是真核信使RNA（mRNA）最丰富的修饰之一，在RNA生物学中起着重要作用。这种修饰的功能是由YTH家族蛋白的m6A选择性“阅读”蛋白介导的，该蛋白将m6A修饰的mRNAs结合到RNA代谢途径中。

作者发现m6A阅读蛋白YTHDC1将发生m6A甲基化修饰的mRNA，从HeLa细胞的细胞核向细胞质进行出核转运输出。YTHDC1的敲除导致细胞核中含有m6A修饰的mRNA保留时间延长，转录本在细胞核内积累，随后在细胞质内被消耗降解。

YTHDC1与剪接因子和核出口衔接蛋白SRSF3相作，促使RNA与SRSF3和NXF1相互结合。YTHDC1识别了m6A碱基的这种作用拓展了mRNA上碱基修饰的潜在效用，为哺乳动物上mRNAs选择性加工和代谢提供了新思路。

//m6A修饰mRNA在细胞核和细胞质中分别被YTHDC1和YTHDF2选择性清除//

m6A促进胞浆和细胞核中mRNAs的清除，YTHDF2通过与m6A修饰的RNA直接相结合，并招募CCR4-NOT脱腺苷酶蛋白复合物参与mRNA降解。

作者通过放线菌酮处理HeLa细胞，然后用LC-MS/MS监测胞浆中mRNA中整体m6A修饰程度。

由于放线菌酮处理使得细胞不再产生新的转录本，使用Control siRNA处理后，胞浆中含有m6A修饰的mRNA更容易被降解和清除，并且能够从m6A/A比例降低过程中计算出一个明显的m6A修饰mRNA的半衰期。在不确定mRNA半衰期情况下，这种方法可以识别在m6A转录本清除的相对速率变化。

胞浆蛋白YTHDF2的敲低导致m6A整体水平升高，并使细胞质m6A修饰的mRNA半衰期延长约4倍。

在转录抑制6小时的时间内，细胞核中mRNA整体m6A水平下降，这表明mRNAs的降解清除机制无论在胞浆还是细胞核中都广泛存在。

对YTH家族中唯一在细胞核中表达的RNA结合蛋白YTHDC1进行敲低后，细胞核内mRNA整体m6A水平升高，m6A修饰的mRNA清除率降低半衰期延长2倍以上。

细胞核中mRNA在对照组和YTHDF2敲低组之间没有差异，证实了YTHDF2主要在胞浆中起主导作用。YTHDC1敲低导致胞浆中m6A修饰mRNA的整体水平降低，但会随着时间推移接近一致。这些数据表明，虽然YTHDF2介导m6A修饰的mRNA在胞浆中降解，但YTHDC1主要介导m6A修饰的mRNA在细胞核中的清除，并影响这些mRNA在胞浆中的丰度。

//YTHDC1调控甲基化mRNA核质转运//

在不改变YTHDF2和出核转运关键蛋白NXF1表达的情况下，利用LC-MS/MS对整个细胞中mRNA的碱基修饰进行分析。结果表明，YTHDC1敲低不影响细胞中整个mRNA的m6A水平，但是会影响m6A修饰mRNA在细胞核中逐渐积累。

YTHDC1敲低后，FISH检测polyA mRNA后发现，细胞核中荧光信号增强而胞浆中信号减弱。这表明YTHDC1在mRNA出核发挥重要作用。

而YTHDC1过表达后，细胞核内m6A修饰mRNA整体水平降低，胞浆中m6A修饰mRNA水平并未升高。作者猜测可能YTHDC1可能与细胞核中RNA降解衰变机制相关蛋白有互作继而导致RNA被降解。

YTHDC1与ZCCH8互作，但YTHDC1与MTR4并不能直接互作。敲低这些蛋白的基因后并没有增加细胞核内rRNA-removal RNA数量。

这些结果表明YTHDC1敲低后mRNA在细胞核内积累可能不是由于核降解机制导致的。

然而作者在干扰YTHDF2后且过表达YTHDC1后，细胞核内mRNA水平降低而胞浆中mRNA的m6A水平显著提高。

这些证据表明YTHDC1介导m6A修饰mRNA出核转运，且这种核定位蛋白可以影响m6A修饰RNA在细胞中的分布。

另外，无论是对照组还是YTHDC1过表达组，4-sU标记的RNA进行pull-down后表明，HeLa细胞中DNA到RNA转录活性并未收到影响，说明YTHDC1主要参与转录后调控。

Tips小贴士：所谓4-sU指的是向细胞中加入核苷类似物4-硫代尿苷（4-thio-urudine），转录过程中4-硫代尿苷整合到RNA链中，产生带有4sU标记的RNA，进一步将这些标记的RNA分离后进行分析。该方法可以用来解析新生转录本。

//YTHDC1影响靶基因在亚细胞中的丰度//

作者进行YTHDC1的PAR-CLIP-seq和RIP-seq两种不同的方法对binding的靶基因进行测序，两者取交集共有737个转录本为两者共有。

对YTHDC1敲低后进行转录组测序发现，细胞整体中无论是737个靶转录本还是其他非靶向的转录本丰度并未受影响。

细胞核中的737个转录本的丰度在YTHDC1敲低后出现显著上升，胞浆中显著降低。

以上结果均表明，YTHDC1能够促进细胞核内mRNA向胞浆内转移。

//YTHDC1介导新生mRNA出核转运//

采用5-EU标记能够在RNA转录期间正在合成的RNA中尿嘧啶U碱基，然后通过各种发光染料准确检测新生RNA。这种技术非常适合检测新生mRNA合成以及RNA复制强度等。

本文作者采用5-EU标记技术来研究YTHDC1对新生mRNA进行定位（通过发光强度）。YTHDC1敲除后，2个靶基因APC和MCL2在细胞核内出现积累，而SOX12差异不明显。反观胞浆中新生成的APC、MCL1和SOX12丰度降低。

这些数据表明mRNA从细胞核向胞浆中转运需要YTHDC1参与，但YTHDC1对非靶基因的出核转运影响不大。

//YTHDC1影响pre-mRNA亚细胞定位但与pre-mRNA剪接无关//

YTHDC1以及RNA上携带有m6A修饰均被证明能够影响RNA可变剪接（RNA甲基化套路解读三：m6A识别酶HNRNPA2B1介导RNA加工-客户文章）（m6A阅读蛋白YTHDC1调控mRNA可变剪切 | m6A专题）

为了确定亚细胞定位是否由YTHDC1介导，作者敲低YTHDC1后进行转录组测序并使用生信的方法分析可变剪接事件。最终确定了426个可变剪接事件（PSI>0.2）。

但是YTHDC1敲低和METTL3敲低后呈现的可变剪接事件呈现微弱的负相关。在426个剪接事件中，仅有85个与YTHDC1有关，108个为非YTHDC1靶基因。此外APL和MCL1外显子剪接并未发生显著变化且SOX12也只有一种亚型。

这些结果证明YTHDC1的确能够影响可变剪接，但是在HeLa细胞中剪接位点选择可能发挥的作用仍然有限。

为了证明YTHDC1出核转运作用不依赖于可变剪接，作者接下来使用了海肾/萤火虫荧光素酶报告基因实验来进行验证。具体质粒载体构建信息如上图所示。

YTHDC1蛋白直接与lambda肽段直接融合，在RNA与蛋白之间提供高亲和力的相互作用。这个工具或技术在研究RNA结合以及mRNA代谢上具有无可比拟的优势。

因此这项技术能够同时提供蛋白合成及mRNA定位在时间解析程度上的信息。转录产物与剪接无关，蛋白上与RNA结合的结构由于lambda肽段互作而与m6A甲基化修饰无关。

质粒上表达的海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶可以在系统内部进行标准化。

在这项技术的帮助下，作者将YTHDC1全长融合到lambda肽段上，通过2小时内萤火虫荧光素酶信号检测翻译强度。

当受到YTHDC1影响而不是G-S-S效应器影响时，作者观察到萤火虫/海肾荧光信号强度显著增加。

这种作用与m6A修饰无关，并且YTHDC1上存在W377A突变。

4小时后，细胞核内荧光信号降低，而胞浆中信号上升。YTHDC1促进胞浆中mRNA水平上升。

进一步分析YTHDC1全长以及YTHDC1 C端的作用后发现，无论全长还是仅有C端促进细胞核内荧光信号增强，促进mRNA从细胞核向胞浆转运。

但是YTHDC1的N端并无产生显著差异的荧光信号。这个结果与先前杨运桂在Molecular Cell上已经发表的结果相吻合，证实YTHDC1的N端参与pre-mRNA的可变剪接（m6A阅读蛋白YTHDC1调控mRNA可变剪切 | m6A专题）。

综上所述，YTHDC1的C端区域与RNA结合，代表着YTHDC1在介导mRNA出核转运上的新机制。  

//YTHDC1通过SRSF3蛋白与m6A修饰RNA选择性结合并介导出核转运//

YTHDC1蛋白与SR蛋白家族互作已经被杨运桂等课题组证实，并介导pre-mRNA可变剪接（YTHDC1调控mRNA可变剪切 | m6A专题）。在这里，何川课题组重复了先前的CO-IP实验证实，YTHDC1与SRSF3等蛋白存在互作。

尽管YTHDC1与SRSF3互作，但是作者并未观察到YTHDC1与NXF1蛋白以及ALYREF蛋白（mRNA衔接蛋白的一种）互作。作者推测YTHDC1出核可能由衔接蛋白介导。

事实上SRSF3介导剪接与出核，并依赖磷酸化的方式与低磷酸化蛋白-出核蛋白互作。

在对YTHDC1的IP产物进行磷酸化检测时作者发现，与YTHDC1有互作的SRSF3蛋白不存在磷酸化修饰。

对内源性SRSF3、YTHDC1和NXF1进行CO-IP后发现，SRSF3和NXF1无论是否存在RNA都强烈互作。但是YTHDC1与NXF1并不能直接互作，两者都可以与SRSF3直接互作。

进一步对内源性YTHDC1的C端和N端进行CO-IP后发现，YTHDC1的C端与低磷酸化SRSF3不依赖于RNA介导，两者直接互作。但是内源性YTHDC1的N端与SRSF3之间没有互作。

YTHDC1-SRSF3以及SRSF3-NXF1蛋白复合物关系确认为m6A修饰mRNA出核机制打下理论基础。

接下来通过CLIP和LC-MS/MS检测后发现，SRSF3蛋白和NXF1蛋白binding上的RNA存在大量m6A修饰且SRSF3蛋白上RNA的m6A修饰程度最高。

尽管在细胞体内蛋白IP产物中RNA存在大量m6A修饰，但是体外实验却表明SRSF3对m6A修饰没有选择性结合。

//SRSF3是甲基化mRNA重要的衔接蛋白//

在HeLa细胞中敲低SRSF3后，细胞核内mRNA的m6A整体水平大幅度上升，polyA mRNA核染色信号增强但胞浆中信号值降低。

敲低与YTHDC1互作的其他蛋白后无论是细胞核还是胞浆，mRNA的m6A水平仅有轻微变化。同样敲低HNRNPA2B1和HNRNPC也不会影响亚细胞中mRNA的m6A水平。

有意思的是，对SRSF3敲低后细胞核内m6A初始水平很高，但清除效率很快，可能有一种尚未揭示的机制在起作用。

综上所述，SRSF3与m6A阅读蛋白YTHDC1以及出核转运因子蛋白NXF1互作促进m6A修饰mRNA出核。此外SRSF3可能针对RNA修饰有额外的作用。

先前研究表明YTHDC1是一种限制性蛋白。敲低YTHDC1、SRSF3或METTL3/14可能导致YTHDC1binding的靶mRNA在细胞核内富集，但不会影响HPRT1（YTHDC1的非靶mRNA）。

在胞浆中YTHDC1或SRSF3敲低会降低YTHDC1靶mRNA水平，但甲基化转移酶敲低则会导致胞浆中YTHDC1靶mRNA整体水平升高。这可能是由于YTHDF2对携带m6A修饰mRNA清除效率降低引起的。

//YTHDC1促进RNA与SRSF3及NXF1结合//

先前报道认为YTH家族蛋白之一YTHDC1含有reader关键的结构域，与m6A修饰的RNA结合。因此作者假设YTHDC1该结构域与mRNA的甲基化修饰是mRNA出核的关键机制。

先前杨运桂课题组已经证实SRSF3结合RNA需要YTHDC1协助（YTHDC1调控mRNA可变剪切 | m6A专题），为了更加深入验证YTHDC1的mRNA出核转运机制，作者对YTHDC1敲除条件下的细胞进行了SRSF3-CLIP，并对binding的RNA进行LC-MS/MS检测。

YTHDC1敲减后，SRSF3富集到的mRNA整体m6A水平要低于对照组。同样，NXF1蛋白binding到的RNA整体m6A水平也随着YTHDC1敲低后降低。

综上所述，mRNA的甲基化修饰以及SRSF3、NXF1都是mRNA出核转运的关键因素，一起发挥重要作用。

//YTHDC1靶mRNA出核需要SRSF3蛋白的结合能力//

SRSF3是YTHDC1靶mRNA出核转运机制中一个十分关键的衔接蛋白。SR蛋白家族其他成员能够直接与出核因子蛋白NXF1互作。

先前的模型推测，被YTHDC1靶RNA需要与SRSF3结合后，才能在结合之后被转运出核。

为了验证这个假设模型，作者通过分析SRSF3的RIP-seq数据以及其他转录组测序发现，只有同时被YTHDC1和SRSF3结合上的RNA才会在YTHDC1敲除后，在细胞核内富集。只被YTHDC1结合而没有被SRSF3结合的RNA在YTHDC1敲除前后，细胞核中富集程度差别不大。

作者还发现YTHDC1和SRSF3相互一起结合RNA的功能与YTHDC1单独结合RNA的功能完全相反。

SRSF3是一种参与多种不同细胞核功能的蛋白。结果表明，SRSF3作为细胞核中甲基化修饰mRNA的出核衔接蛋白之一由YTHDC1和SRSF3共同起作用。

该研究为在细胞核中受YTHDC1结合mRNA的命运提供了强有力的基础，其中下游衔接蛋白SRSF3形成了RNA-蛋白复合物，再与NXF1选择性结合，最终将mRNA输出到胞浆中。

总之在这项研究中，作者发现了m6A甲基化作为细胞核中选择性加工标记，并确定了YTHDC1在介导真核基因表达中的独特作用。

先前大量研究的数据表明，m6A在促进mRNA代谢中起到了关键作用，增强了翻译起始和胞浆中的mRNA降解。

作者的研究表明，对于细胞核和胞浆的mRNA来说，RNA turnover都是非常常见的。甲基化修饰在翻译开始前促进mRNA出核转运，组中导致了mRNA被降解。

本项研究结果将有助于建立m6A修饰介导的mRNA代谢途径，为YTHDC1优先处理m6A修饰mRNA出核转运奠定了理论基础。

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